[CRISPR-Cas Sstem of a Prevalent Human Gut Bacterium Reveals Hyper-targeting against Phages in a Human Virome Catalog]라는 제목의 논문을 읽기 시작했다.
Abstract
: 초록을 읽어보면 먼저 bacteriophage와 gut bacteria 사이의 interaction이 CRISPR-Cas system의 관점에서 잘 연구되지 않았음을 밝힌다. 이 연구에서 보여주고 싶은 점은 Eggerthella lenta라는 박테리아에서 type I-C CRISPR-Cas system을 찾았고 이들이 targeting하는 foreign 또는 chromosomal DNA에 대해서 알아본다는 내용인 것 같다.
Introduction
: 기존에 밝힌 CRISPR/Cas system에서 spacer의 target이 무엇인지 제대로 밝혀지지 않았다는 기존 연구의 한계점을 지적한다. 특히 CRISPR/Cas system이 horizontal gene transfer를 막는다는 점에서 환경과의 관계를 밝힐 필요가 있음을 주장한다. CRISPR/Cas system에 대한 연구가 computational analysis를 중심으로 진행되어 왔음을 설명하면서 이 연구에서 중점적으로 다루는 Eggerthella lenta라는 박테리아를 선택하게 된 이유를 제시한다.
Results
E. lenta의 type I-C CRISPR-Cas system이 활발하게 전사되는지, 그렇다면 이로 인해 mature한 crRNA가 만들어지는지를 실험적으로 검증한다. 첫 번째로, 두 개의 transcript를 만듦을 PCR을 통해 보여주었다. 두 번째로, northern blot을 통해 crRNA가 cas5에 의해서 processing됨을 확인했다. 마지막으로, cas gene 또한 exponential growth 과정에서 활발하게 전사됨을 설명한다.
E. lenta의 type I-C CRISPR/Cas system이 adaptive immune system으로서 functional한지 확인한다. 이를 위해 해당 시스템만 minimal하게 express하는 시스템을 만든다. phage DNA와 self DNA를 targeting하도록 할 때 cleavage가 일어남을 실험적으로 보여준다. 다양한 길이의 spacer가 관찰된다는 점에서 30nt부터 40nt까지 여러 길이의 spacer를 만들어 targeting을 해봄으로써 자연적으로 만들어지는 모든 길이의 spacer가 효과적임을 밝힌다.
E. lenta라는 strain 안에서 variation이 있는 지 연구한 내용을 다룬다. 첫 번째로, isolation에서 얻은 genomic sequence를 이용해 characterization 해봤을 때 cas gene 서열에 따라 A, B의 두 개의 clade로 나눌 수 있다는 것을 보여준다. 또한, spacer의 개수가 어떻게 달라지는지 얼마나 conservation 되어 있는지 설명한다. 이어서 metagenomic data 상으로도 분석을 확장한다.
3개의 public한 dataset을 합쳐서 protospacer matching을 위한 시스템을 구축하고 검증한다. protospacer를 clustering해서 E. lenta를 targeting하는 phage의 종류를 조사해보고 phylogenetic tree를 구성한다. 더하여 PAM sequence에서 type I-C CRISPR/Cas system에서 conserved 되어 있는 "TTC" motif가 나타난다는 점을 보여준다.
소감
CRISPR-Cas system이 protospacer matching을 통해 bacteria 또는 archaea와 virus 사이의 interaction을 규명하는데에도 사용될 수 있다는 점을 배울 수 있었다.